Enjeux

Jamais nous n’avons autant entendu parler de PCR que depuis l’arrivée du Covid 19 dans nos vie. Cette technique, née dans les années 80 est aujourd’hui incontournable et ses applications sont nombreuses. Il s’agit pour les élèves de comprendre comment la PCR exploite la propriété de réplication de l’ADN polymérase mais aussi de découvrir des techniques (PCR et électrophorèse) en relation avec des métiers (technicien de laboratoire, Technicien de police scientifique…).

Place dans le programme

En Première spé : « La Terre, la vie et l’organisation du vivant ; transmission variation, expression du patrimoine génétique. Réplication semi-conservative grâce à l’ADN polymérase. »

Transférabilité

En 2^de : « utilisation pour caractériser la biodiversité… » (ex : Variétés cultivées, biodiversité intraspécifique) En Terminale spé : « holobionte… »

Objectifs

1. Comprendre la technique PCR, son intérêt et ses étapes.
2. Montrer l’utilisation de la technique dans un cas concret.

Exemple de séquence

Temps 1 : Comprendre l’intérêt de réaliser une PCR.

Ancrage dans la réalité : les tests PCR pour détecter le coronavirus.

Les tests de détection directe de l’infection (du virus), reposent sur la technique de PCR (« polymerase chain reaction »). Ils sont relativement rapides (quelques heures) bien maîtrisés par les laboratoires.

C’est ce type de test qui a été mis au point et utilisé par le Centre National de Référence des virus des infections respiratoires (dont la grippe) de l’Institut Pasteur dès le début de l’épidémie en France, au cours du mois de janvier 2020 pour effectuer les premiers diagnostics, puis par la suite transféré dans les laboratoires des grands centres hospitaliers. Il est désormais réalisable dans la grand majorité des laboratoires de ville en France sur la base de cette technique ou de techniques développées par des industriels.

Ce test est réalisé à partir d’un prélèvement biologique, le plus souvent naso-pharyngé avec un petit écouvillon inséré profondément dans le nez. Il doit obligatoirement être effectué par un personnel formé doté d’équipements particuliers et d’une expertise de laboratoire (même s’ils pourraient être utilisés par des équipes médicales mobiles par ex.). Ce prélèvement peut aussi être associé à un prélèvement au niveau des voies respiratoires basses (crachats…). L’échantillon est ensuite analysé en laboratoire afin de rechercher directement la présence du matériel génétique (ARN) du virus et de confirmer ainsi le diagnostic de l’infection. Le délai pour obtenir un résultat avec ce type de test est de trois à cinq heures.

Source : institut Pasteur

Problématique : en quoi consiste une PCR ? Comment ce test permet-il de détecter la présence du virus ?

A partir des documents présentés, argumentez sur la nécessité d’amplifier l’ADN pour le révéler avec une molécule fluorescente. En faisant appel à vos connaissances, vous expliquerez le processus biologique naturel sur lequel repose cette technique et pourquoi la découverte des bactéries thermophiles a été d’une grande importance dans la mise au point de la PCR.

Doc 1 : Principe de la PCR

Principe PCR

Les molécules d’ADN, dans leur état naturel, sont constituées de deux brins complémentaires. Le passage à une température supérieure à 94 °C entraîne la séparation des deux brins de l’ADN et la destruction des structures secondaires (étape de dénaturation).

Les molécules d’ADN simple brin sont ensuite appariées à leurs extrémités à des fragments de petite taille appelés amorces lors de l’étape d’hybridation se déroulant à une température voisine de 54 °C (dépendante de la composition de l’amorce).

Lors de l’étape d’élongation, une enzyme appelée ADN polymérase fonctionnant de manière optimale à 72 °C, vient allonger ces amorces pour former les brins complémentaires aux matrices d’origine générant ainsi deux molécules double brins identiques à la molécule de départ.

Un nouveau cycle (dénaturation - hybridation - élongation) peut alors débuter.

La réaction PCR est constituée de N cycles (généralement compris entre 30 et 40) conduisant à la synthèse de 2 puissance N copies de la matrice d’origine.

Source : https://www.biomnigene.fr

Doc 2 : révélation de l’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose

L’électrophorèse est une technique permettant de déplacer des ions (molécules ayant perdu leur neutralité électrique) sous l’effet d’un champ électrique. Ceux-ci migrent vers leur électrode respective : les anions (chargés négativement) migrent vers l’anode (potentiel positif) et les cations (chargés positivement) migrent vers la cathode (potentiel négatif). L’ADN est une molécule chargée négativement donc, sous tension, elle va migrer vers l’anode. Au cours de cette migration, les brins d’ADN de petite taille migrent plus vite que les brins plus gros ; le gel agit comme un tamis pour séparer les brins d’ADN en fonction de leur taille. Ainsi, au bout d’un certain temps de migration, les petites molécules d’ADN ont parcouru une plus grande distance que les molécules d’ADN plus grandes. Électrophorèse sur gel d’agarose : l’agarose est utilisé à des concentrations de 0,5% à 2% (masse/volume) et permet de séparer des molécules de très grande taille, principalement de l’ADN ou de l’ARN. Les fragments d’ADN sont facilement détectés sur le gel grâce à un colorant fluorescent. On visualise l’ADN en lumière UV.

Doc 3 : Résultat d’une électrophorèse pour différents cycles de PCR

Auteur : Pierrick Maury, consultant SORDALAB

Temps 2 : Appliquer la méthode à un cas concret.

Il existe plusieurs races d’abeilles qui diffèrent par leur couleur, leur comportement, leur physiologie et sont parfaitement adaptées à leur région d’origine. L’apiculture moderne est responsable du déplacement de populations et de croisements qui font que les abeilles de souches pures sont devenues rares. On peut aujourd’hui les retrouver dans des conservatoires comme sur l’île d’Ouessant pour l’abeille noire européenne. Ces isolements géographiques sont à la fois un moyen de conserver le patrimoine génétique d’une population d’abeilles aux caractéristiques bien définies et de protéger les abeilles du varroa, cet acarien parasite qui s’est répandu sur tout le continent et leur transmet des maladies virales. Beaucoup d’apiculteurs de l’ouest de la France travaillent avec l’abeille noire locale et peuvent constater des phénotypes différents dans leurs ruches (des bandes orangées sur l’abdomen de quelques abeilles).

Problématique : un apiculteur achète un essaim estampillé « Abeilles noires ». Peut-il garantir à ses consommateurs l’origine géographique du miel qu’il produit ?

C’est ce que nous allons chercher à savoir en faisant un test PCR sur deux abeilles d’un rucher breton continental en comparant des régions de leur ADN mitochondrial* qui caractérisent les deux souches :

• La séquence P (54 pb)
• La séquence Q plus grosse (192-196 pb).

ADN mitochondrial* : cet ADN est un ADN particulier contenu dans les mitochondries et donc transmis à la descendance par la mère uniquement. La connaissance de l’ADN mitochondrial de n’importe quelle abeille de la ruche informe donc sur l’ADN mitochondrial de la reine et donc sur la génétique de la colonie entière.

Les abeilles noires européennes possèdent les deux séquences PQ (Q pouvant être répétée) Les abeilles nord-méditerranéennes ne possèdent que la séquence Q.

Etape 1 : expliquer la démarche de résolution en utilisant les connaissances acquises au temps 1

Attendus au minimum : il faut trouver une séquence d’ADN qui permet de différencier les abeilles noires des abeilles méditerranéennes (P et Q par exemple), l’amplifier par PCR et la révéler par électrophorèse. L’ADN mitochondrial de l’abeille à tester doit être comparé à l’ADN mitochondrial de référence.

Etape 2 : réaliser une PCR et une électrophorèse pour répondre à la problématique.

Le protocole s’appuie sur celui proposé par SORDALAB dans le kit PCR abeilles

Matériel génétique à disposition :

ADN de références ADN 1 = ADN d’une abeille nord-méditerranéenne possédant la séquence Q ADN 2 = ADN d’une abeille noire possédant les séquences PQ

Deux amorces différentes nécessaires pour dupliquer cet ADN

Des ribonucléotides dans un tampon

Un ADN à identifier* par comparaison avec deux ADN de référence

ADN à tester* : c’est au préparateur de choisir un des tubes de référence et de changer l’étiquette suivant le résultat souhaité.

Préparation des tubes :

Prélèvement des échantillons d’ADN pour les mélanger au tampon, aux amorces ciblant les régions P et Q et enfin à l’enzyme capable de réaliser l’élongation à haute température (TAQ polymerase). Il faut préparer deux tubes de référence et deux tubes test.

Centrifugation pour faire retomber tout le liquide au fond du tube.

Amplification de l’ADN par PCR :

Placement des tubes dans le thermocycleur MiniPCR

Un schéma permet à l’élève de bien comprendre ce qu’il se passe à chaque cycle (dénaturation, hybridation, élongation)

Contrôle du nombre de cycles PCR sur le PC

Séparation des fragments d’ADN par électrophorèse :

Préparation des tubes pour l’électrophorèse : ajout de la substance fluorescente = 2 µl de SAFEGREEN et homogénéisation à l’aide de la micropipette.

Dépôt de l’ADN amplifié dans chaque puits pour réaliser l’électrophorèse sur gel d’agarose. NB : 15 µl si vous avez utilisé le peigne à 9 dents ou 8 µl si vous avez utilisé le peigne à 13 dents.

Etape 3 : présenter le résultat

Prise de photo directement sur le cache noir qui permet de mieux observer la fluorescence.

Observation au début juste après le dépôt (T0)

Observation au bout de 15 minutes

Etape 4 : Conclure en répondant à la problématique de départ

Les deux ADN testés montrent que l’ADN amplifié est constitué de fragments de petites tailles correspondant aux séquences Q uniquement. Nous pouvons en conclure dans ce cas précis, que les abeilles qui ont fourni cet ADN, possèdent des marqueurs génétiques typiques des abeilles nord-méditerranéennes.

Attention : ceci est un scénario pédagogique.